“一花一世界”，这句充满禅意的话在微观视野中得到完美诠释。而构成世间万千纷繁的原子由化学键联合为分子，不同的分子往往具有特异性的化学键振动，成为它们的指纹特征。相干拉曼散射（Coherent Raman Scattering，CRS）显微术便是通过探测目标分子的特征振动来提供成像所需的衬度, 同时基于非线性光学过程大大增强拉曼散射的信号，提高成像速率以及检测灵敏度的新型显微技术^[1][2]。

▲水分子的三种振动模式示意

1. 免标记和分子特异性：CRS 成像的信号来源于目标分子本身，无需外源标记物，也避开了药物小分子等不易标记的问题，在活体（in vivo）观测上更具有优势；可对具有不同拉曼谱的分子进行选择性成像，比如生物样品里常见的脂质、蛋白、核酸和糖类等（如图 1）；

2. 较高的探测灵敏度：相比于自发拉曼，成像速度一般有 3-5 个数量级的提升，一定条件下可实现视频成像速度（每秒几十帧）；

3. 光学层析和三维扫描：类似多光子显微镜的光学层析和三维成像功能；且由于所用的激发波长一般在近红外，有较好的穿透深度和更小的光毒性。

根据非线性光学过程的不同，可将相干拉曼散射分为两种：相干反斯托克斯拉曼散射（Coherent Anti-Stokes Raman Scattering，CARS）和受激拉曼散射（Stimulated Raman Scattering，SRS）。虽然这两种非线性光学现象很早就被发现（上世纪 60 年代），但长期仅作为光谱学测量手段，直到 1999 年以及 2008 年，哈佛大学谢晓亮教授才分别将它们以实用显微成像技术推广开来^[4][5]。

自发与相干拉曼散射的能级示意图见图 2。自发拉曼只需要一束激发光，称为泵浦光（ω_p），泵浦光子与分子发生非弹性碰撞，将部分能量转移给分子振动。因此散射出来的光相对于泵浦光将发生一系列的频率红移，称为斯托克斯光（ω_s），对应到光谱仪中的一系列谱峰，成为该分子的指纹特征。泵浦和斯托克斯光子的频率差正好共振于化学键的振动频率（Ω=ω_p-ω_s），满足能量守恒。对于相干拉曼散射，需将泵浦和斯托克斯这两束激光同时作用于分子，当它们的频率差（拍频）共振于某个化学键的振动时，大量分子的同一个振动模式将被同步（相干地）激发起来，使得散射效率得到大大地增强。最终表现为：泵浦光减弱（受激拉曼损失，SRL）、斯托克斯光增强（受激拉曼增益，SRG），并且出现反斯托克斯（ωas=2ωp-ωs）的新频率分量（CARS）。自发拉曼散射与荧光、吸收等同属线性光学范畴，一般使用连续激光即可。相干拉曼与双光子荧光、二次谐波等都属非线性光学范畴，需使用超短脉冲激光。最常见的用于相干拉曼的光源是皮秒光参量振荡器（OPO），输出两路皮秒光，一束波长固定（如 1064nm），另一束波长在近红外区间可调，它们分别作为斯托克斯和泵浦光。调节激光波长使得我们可以改变待测拉曼频率，选择性地去探测不同的化学键/分子。

CARS 与 SRS 虽然都是三阶非线性光学过程，它们之间有明显的区别：CARS 是个四波混频过程，产生的光子具有第三种频率——反斯托克斯光子 ω_as，因此只需采用合适的滤波片就可以简单地提取出来；而 SRS 是泵浦和斯托克斯光之间的相互转化过程，泵浦光子的湮灭和斯托克斯光子的产生同时发生，但没有产生第三种光子；因此，通常用泵浦-探测技术中常见的调制解调的方式来提取信号，需要借助锁相放大器来实现。CARS 显微成像技术自 1999 年被发明以来，一直受困于非共振背景信号的干扰，典型的表现为光谱发生畸变（图 3）。在苦苦求索了近 10 年之后，谢教授课题组于 2008 年推出了 SRS 技术，完美地解决了上述问题。CARS 过程中能量被封锁于电磁场/光子中，电子跃迁可绕过分子振动直接通过虚能级产生；而 SRS 的发生依赖于光子能量与分子振动之间的交换，具有严格的共振吸收特征。因此 SRS 在光谱上与自发拉曼一致（图 3），在图像上也不再受非共振背景的困扰（图 4）。此外，SRS 的信号与分子浓度呈线性关系，更方便于定量解析复杂混合物体系中的各种化学成分。也因为这些特性，SRS 不断获得研究者们的青睐。

参考文献：

1.Alfonso-Garcia, A., Mittal, R., Lee, E. S. & Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. J Biomed Opt 19, 71407,